植物生理学 第９回講義
ゲノムワイドな遺伝子機能の解析
第９回の講義では、いわゆるポストゲノム研究に焦点を当て、原核生物であるシアノバクテリアを利用した、ゲノムワイドな遺伝子機能解析についてお話ししました。２年生向けの講義としては、さすがに難しかったかも知れませんね。少し反省しております。講義の中で触れたサイトを約束通りここに紹介します。
シアノバクテリアのゲノムデータベース、京大ゲノムネット、ＧＴＯＰ
Ｑ：今回の講義では遺伝子の機能解析について扱っていたが、この講義を聴くことで「タンパク質としての機能はわかるが、それが何にどう働いているのかわからない」場合が多く、そのために「変異体の表現型の解析を一つ一つ行う」というのは面倒だと感じた。研究のストラテジーにおいて、遺伝子変異株の表現型を代謝系のなかで 特定の機能を示すグループに分ける方法が示されていたが既知の遺を伝子が含まれていないとグループ分けした意味がなくなるので、何かもう少し他に良い方法はないものかと思った。また最近注目されているマイクロアレイについての説明はわかりやすかった。極めて多数の遺伝子の発現レベルを短時間にかつ、容易に測定できるのは大変魅力的な方法だと思った。また今まで2種類の蛍光試薬による発光しか知らなかったが2種類の蛍光の強度比を疑似カラーで表示する方法は断然わかりやすいと思いますます研究がしやすい環境が整ったと思い喜ばしく思えた。
Ａ：研究の技法はどんどん進歩しています。となると、あと必要なのはアイデアですね。こればかりはどうにもなりません。
Ｑ：本日の講義を聴いて、マイクロアレイを利用した遺伝子工学の手法や、ゲノム解析の意義について理解できた。一番興味を持ったところは、トランスポゾンを利用して変異株を作った際、CａｔｅｇｏｌｌｙIIでは、トランスポゾンの挿入位置や方向は、変異株によって異なっても同じ蛍光挙動を示したというところである。この理由について考えてみた。CａｔｅｇｏｌｌｙIIではすべて、ｇｌｎＡ遺伝子に挿入されていたということから、遺伝子がｇｌｎＡ遺伝子に挿入されたことにより、ｇｌｎＡの遺伝子が壊れその部分の遺伝子が働かなくなったと考えられる。そのために、CａｔｅｇｏｌｌｙIIでは、ｇｌｎＡに挿入された遺伝子の方向や、位置に関係なくｇｌｎＡの遺伝子は機能しなくなるために、ｇｌｎＡにトランスポゾンが起こった変異はすべて同じ蛍光挙動が見られたのだろう。これは、他の5つについても同じ様なことが述べることが可能であり、その変異が光合成の何に対する変異なのかを調べることによって、その部分の遺伝子の機能を調べることができる。
Ａ：そうです。要は、トランスポゾンの存在の仕方が問題なのではなく、どの遺伝子の機能が失われたのかが問題である、ということなのです。
Ｑ：今回はポストゲノム時代としてのゲノムの利用法について調べてみた。講義ではマイクロアレイによる遺伝子の発現の様子を調べ、系統化するという手法が説明されていたが、遺伝子発現を行うことなく予測する方法もある。講義中では、配列の類似性による解析、として紹介されていた機能アノテ−ション、と呼ばれるこの方法では既知遺伝子塩基配列情報とのホモロジー情報、タンパクのモチーフ情報のデータベースの中から、機械的にゲノムの機能を予測することができる。ただし、高品質なアノテーションを付与するには、遺伝学、免疫学などの専門家による検証が必要である。今、理研を中心にマウスの全長cＤＮＡのアノテーションがＮＴＴなどの協力を得て進行しているようだ。ＦＡＮＴＯＭというマウスcＤＮＡアノテーション情報は既に公開がされており、ゲノムの有効利用が始まっていることを感じた。だが、アノテーションはあくまでポストゲノム研究の効率促進に貢献するものである。この基盤ツールを利用する研究の一つとして、講義中では、比較ゲノム学という分野が挙げられていた。これは、ゲノム配列やcＤＮＡ配列を用いての比較進化解析を行うもので、例えば、多重遺伝子族を形成する遺伝子群が遺伝子重複とドメインシャフリングを通じて多様化した時期の推定や、進化過程・ゲノム構造進化のメカニズムを明らかにしようとするものである。今回の講義やネットでの検索を通じて、研究の次元がゲノムの真の価値を問う段階に着々と移行していることを肌で感じた。
Ａ：ゲノムの研究は本当に日進月歩です。しかも、ヒトの研究の場合は、医療がらみでお金になりますから、企業による研究も盛んです。今はまだゲノムの研究をしている段階ですが、そのうち、ゲノム情報は、「研究以前に当然収集しておくもの」になるのではないでしょうか。
Ｑ：今回の講義は、実験の実例としてクロロフィル蛍光を用いた光合成遺伝子の解析を扱っていたが、全体的な講義の主旨は、遺伝子の機能解析であり、今までの植物生理学の講義とは内容が異なっていたと思う。その分だけ違う観点から植物の光合成を考えることができ、非常に参考になった。
遺伝子の機能解析の具体的な手段として、配列の類似性と、変異型の表現型の二つの方法が挙げられていたが、光合成遺伝子の解析では、その遺伝子が光合成にどのように関わっているのかを知るために後者の解析を用いていたが、前者の方法で行ってみるとどうなるのかを考えてみた。
まず、既知の遺伝子とのホモロジーを探すという最初の課題だが、これは配列がわかっている遺伝子がまだ多いわけではないということから現在では大変な作業だと思われる。しかし、光合成に近い経路を持つ好気呼吸やその他の同化、異化において機能するタンパク質で、配列がわかっている遺伝子のものと比較すれば、ある程度確率が上がるのではないかと考えた。また、タンパク質の機能がわかっても、システムの中のどの位置で働くのかがわからないという課題も、このような比較である程度の予測がつくのではないかと思う。
このように配列の類似性を利用した解析でも結果を得ることができるのではないかと考えてみたが、実際に遺伝子を発現させて結果を見るという過程がない場合は、確信を持って遺伝子の機能を同定することはできない、ということを感じた。この点では、講義の後半で出てきたDNAマイクロアレイは視覚的に発現量を捕らえることができるので使用しやすいことがよく分かった。
Ａ：今、バイオインフォマティクスという言葉がはやりで、配列情報や発現情報から、意味のある情報を取り出す研究が盛んになされていますが、その結果が、生化学・分子生物学・生理学にフィードバックされた例は必ずしも多くありません。今後は、バイオインフォマティクスと実験生物学が融合した分野の発展が期待されます。
Ｑ：クロロフィル蛍光の微妙な変化の検出とマイクロアレイの実験によって、シアノバクテリア遺伝子の機能解析ができるということだった。これにより、遺伝子の推定機能ネットワークというものが作成できると知り、驚いた。私はゲノム解析のあと、つまりポストゲノム研究とは、まずアミノ酸配列からのタンパク質の立体構造予測、それからそのタンパク機能の解析、という流れで進むのだと何故か勝手に思い込んでいて、これは大変で時間もかかるだろうと思っていた。だが、今回の講義のおかげでこの思い込みが誤りで、遺伝子の機能解析を先にすることもできるとわかり良かった。遺伝子の機能解析はそれでも大変だろうが、一旦遺伝子推定機能ネットワークができてしまえば、そこから先の解析は飛躍的に進むのではないかと思った。
講義の最後に、一般の人でもシアノバクテリアのゲノム情報を見られるホームページが紹介されていたが、率直に言って、一般の人にとってそれは全く役に立たず、見ても仕方ない情報だと思った。だが、それと同時に研究者であっても、ゲノム情報の上手い解析法を見つけなければ、ゲノム情報がいくら解読されたところで、何の役にも立たない情報になってしまうだろうと思った。
Ａ：タンパク質の立体構造予測も現在非常に進歩しつつある分野ですが、まだ、機能予測につながるという所までは行っていないでしょう。
確かに、一般の人でも、研究者でも、アイデアがなければ膨大な情報の海におぼれるだけです。ただ、アイデアがひらめいたら、誰でも情報にアクセスできるという状態は、すばらしいのではないでしょうか。
Ｑ：今回学んだ遺伝子機能の解析方法では、細胞内に膜系器官を持たない原核生物を用いて、クロロフィル色素の蛍光挙動の違いを調べるものであった。原核生物は、真核生物の遺伝子発現に必要な酵素タンパクなどを持たないので真核生物の遺伝子機能の解析はできないのか？それは、原核生物型のプロモーターを連結することで解決するのか？また、真核光合成生物には存在するが、原核光合成生物には存在しないようなシステムがあった場合は、蛍光挙動に変化が見られたとしても、どのような機能が成されているのかは判断できないのだろう。つまり、この遺伝子機能の解析法は、真核光合成生物と原核光合成生物の間で共通する遺伝子配列においてのみ機能の解析が有効ということなのだろうか？
Ａ：疑問に思ったら、できれば自分でその答えを考えてみてください。もし、この方法が原核生物にしか応用できなくて、自分は真核生物の情報が知りたかったらどうすればよいでしょうか？そのような考え方が新たな研究の出発点となるのです。別に、このような質問には「正解」があるわけではありませんが、僕ならば、細胞質の代謝系の鍵となる代謝物質に蛍光ラベルをつけてみたらどうだろうか、などといったところから考えてみるだろうと思います。
Ｑ：今回の講義では私にとって、今までの講義の中で１番難しかった。遺伝子の機能解析でクロロフィルの蛍光を使うという方法は初めて聞いたので新鮮なものであったが、いまいちよく分からなかった。トランスポゾンやマイクロアレイについても自分自身の知識が少なく、かろうじて分かった程度であった。クロロフィル蛍光を用いた解析で、光合成に関与している遺伝子の欠損を検出することはわかったが、光合成に関与していない遺伝子の欠損も光合成の色素でとらえることができるということが不思議に思った。また、改めてゲノム情報が明らかになっていく利点について考えさせられた。ゲノムを解析することによってさまざまな研究に役立っていることを知った。（でも、実際、自分はまだ実験や研究をやったことがないので、深くは理解していないが…。）まだ未知な遺伝子でもその機能について有用な情報を得ることができれば、もっと進歩するのではないかと思う。来週は最後ですね。光合成を研究してどんな新しいことが発見できたのか、今後、植物は進化するのか知りたい。
Ａ：今回のような研究内容の紹介は、実際に研究を始めていない人には、イメージがつかみにくいと思います。なるべく、易しく説明したつもりではあるのですが、もう少し工夫した方が良さそうですね。
Ｑ：今回の授業でマイクロアレイについての具体的な使用法について始めて分かったと思う。この前日の授業でハイブリタイゼーションの一括作業の方法としてマイクロアレイが出てきたのだが何ゆえわざわざこんなものを作るのかピンと来なかったからだ。事前に先生方の間で連携を取っているのかもしれないが、こう毎日の授業につながりがあると記憶しやすくていいと思う。それ以外に気になったのは、はたしてシアノバクテリアの非光合成遺伝子のクロロフィル蛍光解析の有用性について気になった。本来はこのような基礎研究が何らかの所で役に立つのだろうけど、これに関してはそれが見えなかったからだ。シアノバクテリアは確かに葉緑体の祖先だろうけど、その光合成を行うという以外の機能を植物の核に遺伝子レベルで譲ってしまっているというのを以前の授業で習ったからだ。これでは、いくらシアノバクテリアについて非光合成遺伝子について解析してもその殆どがシアノバクテリアかそこから派生した真性細菌類とたどっていける祖先にしか適応されてないのではないかと感じたのだ。現在の植物の葉緑体においての対応するものがあるなら、それらの働きというもの知りたかったと思う。また、シアノバクテリアで用いた方法は、原核生物であることから光合成と他の諸反応のかかわりを探ったものである。真核生物である植物細胞において同等の事を調べるにはどうすべきなのか。地道に蛋白質を追いかけることになるのだろうか。気になった点である。
Ａ：僕は東大から来ているので、実は理科大の先生と連携をとることはほとんどできません。残念ながらただの偶然です。
高等植物の場合も、葉緑体に局在する遺伝子についてならば、同じような解析手法がとれると思います。現在、そのような研究も始めつつあります。
Ｑ：早いものでこの植物性理学の授業も残すところあとわずかになってしまった。植物のミクロな構造、光合成の仕組みなど駆け足で見てきたが今日は遺伝子工学を使って研究していくその実際というものを見せてもらった。最近の遺伝子工学の授業でやったマイクロアレイや蛍光を使っての研究の手法は原理も知っておきたいし実際にどういったときに使うかも重要であるから今回のように実際研究の中で使われていることが示されると今までは教科書の中の遠い存在だったものが急に身近なもののようにおもえて良かった。
シアノバクテリアのゲノム研究によって進化の過程であったり生物の特徴の一端が見えてくるようだった。塩基配列を比べることで機能が見えてくる。塩基から機能を見るにはどこかの機能に着目して注意深くみて差異をみつけなくてはいけない。ゲノムを扱う技術も必要だがそれと同じくらい表現系を見分ける観察眼が無くてはいけない。しかし観察眼というのはいま学校で習っている授業からでは育ちが悪いように思う。いまやっているのは知識の詰め込みなのだが、それ以外にも観察眼を養うことをしておこうと思った。来年から始まる実験で注意深く目が働くよう今から意識しておこうと思った。
異常というものはいつもの普通の状態をしらないとわからない。だから普段がどういう風になっているかをちゃんと勉強しようと思った。
Ａ：数学の場合は、よく知りませんが、頭のできが成功するかしないかを決めるのでしょう。生物の場合は、実験をしてみると思いもかけない結果が出て大発見につながり、成功につながる場合もあります。ですから、数学に比べれば、才能がなくてもよいのかも知れませんが、それでも、実験結果の中から「異常」や「気になる点」を見つけ出す能力は必要です。というよりも、そのような能力こそが生物学者に求められる能力なのだと思います。
Ｑ：トランスポゾンを使って変異株を作ることによって発現に変化を与える、このことに興味を引かれました。他の講義でもよく耳にする話なのですが疑問点がかあります。トランスポゾンは動く遺伝子と習ったので、どこに挿入されるのか分からないのではということです。これはglnA遺伝子のみにしか挿入されなかったですか。動く遺伝子ならば、一定の配列の所のみにしか入らないとは限らないのではないでしょうか。蛍光挙動が皆同じであったとしても、他の配列からの影響ということはないのだろうか。実際に実験をやったことがないため、自分の思い描いているトランスポゾンの意味が間違っているのかもしれませんが、どうしてglnAのみに入っていたと分かったのですか。
Ａ：その通りで、トランスポゾンを用いた変異株の場合は、どこにトランスポゾンが入っているかが最初はわかりません。そこで、１つずつ、トランスポゾンの近傍の遺伝子配列を読むことによって、どこの遺伝子が破壊されたのかを調べるのです。その結果、glnAの配列が読めてきて初めて、ああ、この変異株はglnAが破壊されていたのか、とわかるわけです。
Ｑ：今年の４月にヒトゲノムが決定しました。一般の中には、ナンデモ分かるようになったと誤解している人もいます。私も最初聞いたときは、その意味が理解できませんでした。塩基配列が分かってもイントロンがあり、どこが遺伝子なのか、またその遺伝子がどのような機能を持つのかが分からなければ意味がないのです。今回のシアノバクテリアの遺伝子の推定機能ネットワーク構築は大変興味深かったです。ゲノム規模が違いますが、これらを応用することでヒトの遺伝子発見につながると考えたからです。それにはまず、蛍光のように機能が明らかに観察できるような現象の発見が必要です。ヒトの遺伝子のうち個人的に興味があるのは、ガンなど病気に関するものです。しかし、この場合指標となる現象を発見したとしても、シアノバクテリアのように変異を加えることは倫理上不可能です。そうすると、他の生物で実験を行い類似配列という形でヒトに応用するのが適当だと思います。今回の講義の、シアノバクテリアにおける遺伝子特定の過程は、私にとっては難しかったです。
Ａ：人の研究の場合などは、培養細胞などを使って何かできるかも知れませんね。今回は、少し難しすぎたようで反省しています。
Ａ：様々な生物のゲノムが決定していることは耳にしていたがグラフで見るとその増加に驚いた。これからその解析によって進化の過程やゲノムによる病気の治療法の発見など、どのように活用するかが今までのゲノム解析より重要になってくる。そんな世界中で競っている中で解析したゲノム情報が、インターネットで見たいときに簡単にわかることは研究の進歩におおいに貢献するだろうと思う。解析できたものは特許などにも関わってきて、そんなに簡単に公開しないものではと思っていた。今日の授業では、光合成遺伝子の欠損を光合成のクロロフィル蛍光のキネティクスで確認できたのには驚いた。直接関係しないものでも見方をかえることで関わってくることはとても勉強になった。今の授業はほとんどが知識の詰め込みなためとても新鮮に感じる。同時に研究するにはたくさんの知識必要だから今の授業も大切だとこの授業をうけて痛感することができた。
Ｑ：確かに知識は必要ですが、全ての知識を自分の頭の中に持っている必要はないかと思います。必要に応じて、質問できる相手、検索する手段、などの情報ネットワークを充実させておくのが一番よいでしょう。もちろん最低限の知識は頭の中にないと、質問すらできないでしょうけれども。
Ａ：今回の講義は扱われた実験内容も含めて感心させられることの多いものだった。自分が研究したいテーマに適した実験材料を選んだり探したりするのはその実験の成功不成功を占うほど重要なのだとわかった。成功したとしても他のグループに似たような研究発表を先にされてしまったらオリジナルでなくなってしまうので、実験スピードの意味でも最適な材料は欠かせないだろう。今回最も興味をもったのは、トランスポゾンを使って遺伝子をランダムに変異させる実験方法だ。抗生物質耐性の遺伝子をあらかじめ挿入しておいて後で選択できるようにしておくのは常套手段だと思うが、細胞に混ぜるだけでトランスポゾンを取り込む、形質転換のしやすい原核生物を使っている。はじめからトランスポゾンを利用した遺伝子破壊をすることを見越して実験材料を選んでいたのかどうかはわからないが見事だと思った。形質転換のしやすい生物を使っているにもかかわらず変異株は15しか取れないのだから、形質転換のしにくい生物を使っていたらこの実験は大幅に遅れるか、もしくは中断してしまっていたことだろう。他に、実験結果を他人に納得させるための手法がいくつかあった。おもしろかったのは結果の定量化だ。見た目だけでは人それぞれ見え方に個人差があるわけだから、それを数値化してしまえば誰もが同じように解釈できる。さらに定量化によって実験結果をかなり扱いやすくなっている様にも思えた。
Ｑ：昔、遺伝学にショウジョウバエを使い始めた頃から言われていることですが、生物の研究に材料の選択は極めて重要です。また、科学にとっては、客観性は重要ですから、結果の定量化も同様に重要です。ただ、結果を扱いやすくする、ということは、一部の情報を捨てている、ということでもあるので、注意する必要があります。
Ｑ：今回の講義では、実際に研究をどのように進めていくかを説明していたのでとても参考になりました。遺伝子をノックアウトしてから、その遺伝子が何の働きをしているか決定する難しさを知りました。
講義では光合成の遺伝子の欠損についていろいろな方法で分析しましたが、僕は次のような実験を考えました。葉から葉緑体を抽出して、その溶液の吸光度を測っつたらどうでしょうか。吸光度が高ければ、その葉は葉緑体をたくさんもつことになります。また、正常な葉の吸光度とノックアウトした葉の吸光度を比べ、その違いから機能の変わったたんぱく質を同定できるのではないでしょうか。
実験方法というのは考え方によっていろいろできるとわかりました。これからも実験するとき他の方法はないかと考えるようにしようと思います。
Ａ：このように、自分で研究の方法を考えてみる、ということは非常に重要です。ただ、葉緑体の量に関しては、たぶん、見た目の色の薄さで情報が得られますよね。１つ１つから葉緑体を取るのは大変でしょうから、実際には、デジタルカメラで写真を撮って、緑色の成分を定量化する、といった方法をとれば、多くの個体の解析を一気に進めることができるのではないかと思います。