植物生理生化学特論 第10回講義
光化学系Ⅰの光阻害
第回の講義では、低温感受性植物の低温障害の原因となる光化学系Iの光阻害のメカニズムについて解説しました。以下に寄せられたレポートとそれに対するコメントを載せておきます。
Ｑ：講義で紹介されていた、in vivo、in vitroでの光化学系Ⅰ阻害の比較表について、in vitroでは温度条件によらず光化学系Ⅰの阻害が起こることが示されていた。この結果から、葉の中では系Ⅰの保護機構が働いておりその機構が低温で失活すると示されていたが、保護機構は低温耐性の有無にかかわらず存在するとも考えられるため、vivoとvitroの比較で観察された保護機能自体が低温で失活しているとは断定できないと考えた。そこで、この保護機能はすべての植物で恒常的に働いており、低温耐性植物における別の保護機能が働いていると仮定した。ここでは系Ⅰの阻害を防ぐ方法について考察した。系Ⅰの光阻害と系Ⅱとの関係性に着目すると、系Ⅰの阻害は系Ⅰに電子が供給される場合のみ起こるため、系Ⅰと同時に系Ⅱが阻害されれば電子過剰による還元と活性酸素の発生を抑えることが出来るはずである。これを検証するには、低温耐性植物と非低温耐性植物において、低温弱光環境で系Ⅱの阻害が起きるかin vivoの系で比較する必要がある。系Ⅱの阻害は回復が早いため、低温耐性植物において一時的に系Ⅱの阻害速度が増加していることを確認できれば、系Ⅱの阻害によって系Ⅰの分解を防いでいると考えられるのではないか。
Ａ：全体の考え方としてはよいと思うのですが、「低温耐性植物における別の保護機能」を仮定する意味がよくわかりませんでした。「保護機構は低温耐性の有無にかかわらず存在するとも考えられる」とありますが、むしろそれが前提で、両方の植物で見られるからこそ、片方だけで失活しているのだろう、と推論したわけです。その保護機構として、系IIの光阻害がある可能性は十分に考えられると思います。
Ｑ：過酸化水素の系Iへの阻害を考える。暗所では過酸化水素による阻害が見られなかった一方で、明所では過酸化水素による阻害が見られた。暗所と明所におけるこの阻害の有無の違いが生じた原因を考える。系Iの光阻害のメカニズムとして、過酸化水素は還元型の鉄イオウクラスタと反応し、生成されるハイドロキシラジカルが鉄イオウクラスタを破壊する。このメカニズムに基づくと、過酸化水素が多いほど、ハイドロキシラジカルが多く生成され、阻害は臨界値に達するまで大きくなると考えられる。しかし、明所では阻害が生じるのに対し、暗所では阻害が生じていない。このことを考慮すると、鉄イオウクラスタと過酸化水素からハイドロキシラジカルが生成される反応、あるいは、ハイドロキシラジカルが鉄イオウクラスタを破壊する反応において、光を受けてエネルギーを得ているのではないかと考える。これを定量的に検証するために、強光下と弱光下でそれぞれ阻害がどの程度生じているのかを測定する。また、同時にそのときの光照射のエネルギーを測定することで、グラフ化し、検証することができると考える。
Ａ：結論から言うと、フェントン反応は金属イオンが還元型の場合にのみ進みますので、光によって光化学系Iの受容体である鉄硫黄クラスタの鉄が還元されるとフェントン反応が起こることが推定されます。この点は、講義の中で言っていると思うのですが……
Ｑ：低温感受性と低温非感受性の植物のゲノム解析結果を用いて網羅的にその違いを調べることで低温に応答する酵素などを見つけることで、通常時の光化学系I保護メカニズムを解明できると考えた。単離したチラコイド膜では低温感受性の植物とそれ以外で違いがみられなかったことから、in vitroでより詳しい生理学的メカニズムを確認する実験系を確立するのは難しいと考えた。そこで、ゲノム解析で対象となり得るタンパク質をある程度決定してからin vivo で変異体を用いてそのタンパク質の機能を解析するのが妥当だと考える。候補になったもののノックダウン体を用いて低温に依らず光化学系Iの活性が下がることを確認し、回復実験を行うことで長い期間(7日以上)で通常に出の光化学系Iの活性が戻っていることを確認することでそのタンパク質によって光化学系Iが保護されていることを示す。
Ａ：論理の流れはよいのですが、「ゲノム解析」ではなく網羅的な（ゲノム単位での）解析ではないでしょうか。「低温に応答する酵素」を見つけるという場合、その酵素の遺伝子自体は低温感受性であるか否かにかかわらずゲノムに存在し、その発現もしくは活性が変化することを想定しているのではないかと思います。
Ｑ：系Iの光阻害と共にサブユニットが分解され、クロロフィルも分解されることが示唆されていた。講義ではクロロフィルそのものの分解についてのみ示されたが、クロロフィル生合成経路の上流化合物の安定性も考えられる。これを調べる実験系としては、系I阻害時のクロロフィル生合成経路上流化合物の物質量を比較する、またはサブユニット分解時のクロロフィル生合成経路上流化合物の物質量を比較することで満たせる。系I阻害とクロロフィル量に弱い相関があることから系I阻害時のクロロフィル生合成経路に影響している可能性が予想される。
Ａ：物の量が減った時に、分解が亢進しているのか、合成が低下しているのかというのは、常に考えなければいけないポイントだと思いますので、よい題材だと思います。この点について考える場合に、重要なのは代謝回転の速度です。もし、代謝回転が非常に早ければ、合成が物質量を律速する可能性が高くなるでしょうし、逆に極端な話、成熟した細胞などで代謝回転ほとんど起こらない系では、分解の亢進が全体量を決めると思います。そのあたりの考察も少し欲しいですね。
Ｑ：光阻害が起きた時、光化学系Ⅰを積極的に分解する酵素が働くとしたら、その酵素とその酵素を誘導した物質が増えている可能性は高くないだろうか？光阻害が起きた時のタンパク質の泳動像を見てみると、12 kDa以下に（誤差レベルで）濃くなっているバンドがあるように見える。それでなくともタンパク抽出のやり方を検討して酵素を探せると考えられる。
Ａ：この点は面白いと思います。講義で示したのは、阻害直後のタンパク質の泳動像ですが、もし分解酵素を探すのであれば、阻害後３日ほどで分解が進むことを考えると、例えば阻害後１日経過した時点でのタンパク質を解析した方がよいかもしれません。
Ｑ：今回の講義を視聴して、チラコイド膜の活性酸素を除去するために加えた薬剤のうち、系Iの光阻害を軽減できた薬剤がn-propyl gallateのみであったことに疑問をもった。過酸化水素をチラコイド膜に加えたことで光阻害が増大した実験から、過酸化水素の濃度と光阻害の程度には相関があると考えられる。それにも関わらず過酸化水素の分解酵素であるカタラーゼや、不均化すると過酸化水素になるスーパーオキシドアニオンラジカルの分解酵素であるSODが光阻害を軽減しないという結果は一見矛盾していると考えられる。このレポートではこの矛盾について考える。1つ目の仮説は、添加した薬剤の分子量の差が光阻害を軽減したか否かを分けたという説である。これは光阻害を軽減できたn-propyl gallateが小分子である(1)一方、効果がなかったカタラーゼやSODは酵素である点に着目した説である。光阻害がはたらく部分が小分子のみ透過しやすい場所、例えばチラコイド膜内である場合、小分子であるn-propyl gallateのみ光阻害を軽減できたことに説明がつく。しかしn-propyl gallateは極性分子であるため膜透過性の観点から考えると、この仮説の蓋然性は低いと考えた。また同じく膜透過性のない極性分子である活性酸素が光阻害を増大させている事実も、この仮説の蓋然性を低くしている。2つ目の仮説は光阻害の過程ではスーパーオキシドアニオンラジカル→過酸化水素→ヒドロキシラジカルの一連の反応が非常に速く起きるという仮説である。この仮説が正しい場合、生成されたスーパーオキシドアニオンラジカルや過酸化水素は、すぐにヒドロキシラジカルへと変化するため、それらの分解酵素によって分解される確率が低くなる。このため反応過程のスーパーオキシドアニオンラジカルと過酸化水素の分解酵素では光阻害を軽減できず、最終産物であるヒドロキシラジカルを除去するn-propyl gallateのみ光阻害を軽減できたことに説明がつく。また過酸化水素を加えることで光阻害が増大した事実とも、この仮説は矛盾しない。ただし、いくら速い反応とはいえスーパーオキシドアニオンラジカルと過酸化水素の分解酵素が一切光阻害を軽減しないのかという点は、やはり疑問として残った。
参考文献(1) 没食子酸n-プロピル. 富士フイルム 和光純薬株式会社.https://labchem-wako.fujifilm.com/jp/product/detail/W01MPB02102747.html. (2022年6月19日閲覧).
Ａ：これはよく考えていますね。感心しました。１つ目の仮説の変種として、小さな分子であればタンパク質の特定の微小環境に入り込めるという考え方もありそうです。光化学系Iの光阻害の場合、電子受容体である系I複合体上の鉄硫黄クラスタが酸素を還元し、生成した活性酸素種が還元された鉄硫黄クラスタとフェントン反応によりヒドロキシラジカルが生成し、これがそのまま鉄硫黄クラスタを破壊するわけですから、すべての反応が鉄硫黄ラスタのごく近傍で完結します。生成した活性酸素種などが溶液中と平衡にならずに局所的に反応が進むのであれば、その場所へのアクセスが可能な小分子だけで効果が見られたことが説明可能かもしれません。
Ｑ：今回は光化学系Iの光、低温阻害について学んだ。キュウリの系Iは低温で阻害されるのに対して、ホウレンソウは阻害されない。この違いを利用して、低温で阻害されないキュウリを作れないかと考えた。シアノバクテリアには遺伝子挿入によって二次的な被害が出ないニュートラルサイトと呼ばれる遺伝子領域がある。植物にニュートラルサイトのような部位があるのであれば、低温阻害を受ける植物のニュートラルサイトに低温阻害を受けない植物の光化学系Iをコードする領域を挿入することで低温阻害を軽減できるのではないかと考えた。
Ａ：今回の講義の結論は、低温感受性は光化学系Iの差によるものではない、という点にあります。もう一度講義を確認してくださいな。
Ｑ：今回の講義の中で、光化学系Ⅰが低温処理により活性がなくなるためその状態で光エネルギーを吸収することは危険だということから光化学系Ⅰ及びクロロフィルが分解されるという考えがあった。私は、光化学系Ⅰだけでなくクロロフィルも低温処理後に分解されるのには他の要因も関与しているのではないかと考えた。それは、光合成と呼吸のバランスである。低温処理を行うことにより光化学系Ⅰは不可逆的に阻害される。このことにより、低温処理が施された部分は光合成をしたとしても、糖は通常時よりも少ない量しか得ることができない。しかし、光が当たらなくなると呼吸により糖は消費されてしまう。このことから、生産される糖と消費される糖のバランスが取れなくなってしまうことからクロロフィルを減らし、光の吸収だけでなく呼吸も抑えようとしているのではないかと考えた。
話は変わるが、低温処理後に減ったクロロフィルの量に比例してより強い光を当てていく実験をしてみると面白いのではないかと感じた。この実験の結果は環境に適応しようとして光化学系Ⅰの回復速度が上がる・クロロフィル量がさらに減少する・葉が枯れるといういづれかの結果になると予想する。これにより、クロロフィル及び光化学系の環境適応力を見ることができるのではないかと考える。
Ａ：前半の部分は、クロロフィルを減らすと呼吸が抑えられるというロジックに読み取れますが、なぜクロロフィルと呼吸が関係するのかが理解できませんでした。後半の、いわば追加実験は面白いと思いました。ただ、それだけ継続的に変化を追いかけるとかなりの期間の実験になりますから、葉の寿命との兼ね合いで、老化の影響を受けないように解析するのは案外難しいかもしれません。
Ｑ：本講義の最後で系Ⅰと低温感受性の関係についての展望があった。ここで私は、低温感受性の刺激感知に関してよりマクロな視点で見る必要もあると考える。今回紹介された研究ではオルガネラ単位や器官単位で分離して実験を行っていたが、実際の植物体ではオルガネラ・細胞・組織などの単位で相互作用しながら反応している。例えばオーキシンは産生部位と作用部位が異なる。低温という刺激を葉以外の器官で感知し、最終的に型Ⅰの動態に関与する化学物質を他の器官で産生している可能性もある。したがって植物体そのもので同様の実験を行い、同様の変化を起こすのか、確認する必要があると考える。また本来植物が低温刺激を冬季に経験する。よってそれ以外の季節に「誤って」反応しないように、温度以外の要因と合わさって反応を変えている可能性がある。特に系Ⅰ回復の時間変化のように日数単位で観察する実験に関して、温度以外の要因も操作し比較することで、野外植物の動態に迫ることができると考える。
Ａ：これは、まさにその通りですね。ただ、実際に実験しようとする場合には、実験設定が案外難しいように思います。葉の光合成の阻害とは別に、低温は根における水および栄養塩の吸収を阻害します。２か所で独立に阻害が起こる場合に、得られた結果が独立な阻害の結果なのか、相互作用の結果なのかは解析が難しいですよね。実際の野外での温度を考えると、土壌の温度は、地面からの深さによっても異なると思いますし、水の比熱が大きいことを考えると、水分含量によっても異なるでしょう。単純に野外の状況をまねればよいというものではない点も悩ましいところです。
Ｑ：低温感受性植物と、低温耐性植物で光化学系Ⅰを保護するメカニズムの違いについて、自分の考えを記述する。講義では光化学系Ⅰの阻害には活性酸素が関与していること、また活性酸素の濃度が上がれば上がるほど光化学系Ⅰが活性をほとんど失うまで落ちることを学習した。結論自分は、光化学系Ⅰを保護するメカニズムに違いはなく、それが低温で阻害されるのも共通であると考えた。しかし、低温感受性植物と低温耐性植物ではそもそも生成される活性酸素量が異なると考えた。過酸化水素の構成要素であるプロトンは水から分解され作られる。低温耐性植物である冬野菜に根菜や根が短く単純な構造が多いのは、表面積を小さくすることで水分の吸収効率を下げることで、乾燥や凍結対策をしているためであると考えられる。そのため、低温感受性植物と低温耐性植物では水分含量に違いがあり、それがプロトン量の差すなわち過酸化水素量の違いとなっている。そのため、低温で光化学系Ⅰを保護するメカニズムが阻害された後でも、もともと活性酸素量が少ない低温耐性植物では系Ⅰの阻害があまり起きないことが考えられる。
Ａ：議論の前提となってる「過酸化水素の構成要素であるプロトンは水から分解され作られる」という表現は、少なくとも化学的にはあまり適切ではないように思います。ただ、広い意味での水の「活量」のようなものが、阻害に影響を与える可能性はあるのかもしれません。
Ｑ：植物の活性酸素生成について調べたところ、系１では活性酸素発生を防ぐためにP700が酸化されていることを知った（P700酸化システム）[i]。このシステムは光合成抑制環境下でO2へのエネルギー移動を抑制することで活性酸素の発生を防いでいる。ここで低温感受性植物において不可逆的な系１の阻害を行うのは、このP700酸化システムでは対処できない場合なのではないかと考えた。授業において系１の阻害は不可逆的であるため、可逆的に阻害される系２阻害時よりもその影響が大きいことを学んだ。影響力の小さい方法で環境へ対処する方が良いというイメージがあるためこれに違和感を覚えたが、系２阻害→P700酸化システム→系１阻害の順に進化したのであれば、低温ストレスが系２阻害、P700酸化システムでは対応できないほど大きいので、系１阻害で対応していると考えられ納得がいく。低温感受性のあるシアノバクテリアが系１阻害ではなく、系２阻害を行なっていたら上記の進化順のうち系２阻害→系1阻害が証明できると考えた。またP700酸化システム確立時期が植物の陸上化の時期と、系１阻害が陸上植物の分布域の拡大時期と被っていたらより多様な光環境への適応のため系１制御を開始したことを意味するので、進化順が支持されるのではないかと考えた。
[i] 神戸大学、「植物が酸化障害を防ぐメカニズムを解明」、https://www.kobe-u.ac.jp/research_at_kobe/NEWS/news/2017_05_16_02.html
Ａ：よく考えていてよいと思うのですが、環境変が変わった際の生物の変化には、応答もあれば傷害もあって、この二つは意味が違うことを考える必要があります。系IIの阻害はもしかしたら（積極的な意味のある）応答かもしれない一方、系Iの阻害は（植物としてはできれば避けたい）傷害なのだと、僕は考えています。そうであれば、レポートに述べられた違和感は正しいことになります。
Ｑ：活性が失われた系Ⅰの回復について考えた。系Ⅰにはきわめて低速ながらも一応の回復手段が備わっていながら、低温環境下に置かれた葉はその後積極的な系Ⅰの分解を行うということは、光合成に用いる系Ⅰを失った面積と同じ大きさの葉を再度作りなおすコストを、回復速度の遅さに伴う不要な光エネルギーの蓄積が持つ危険性が上回っていることを示す。このことを踏まえ、活用方法の無いエネルギーを熱エネルギーに変換することで温度を上昇させ回復速度を速める機構、あるいは系Ⅰの回復を直接的に行う機構を人為的に導入することができれば、極めて冷害に強い品種の開発が可能になることが考えられる。
Ａ：「冷害に強い」ということを２つのケースに分けて考える必要があるように思います。イネの場合のように夏の一時的な低温が問題であれば、それをやり過ごせば温度はまた正常に戻るでしょう。一方で、夏野菜のキュウリが秋が深まるにつれて低温にさらされる場合には、そこを一時的に切り抜けたとしても、やがては冬に向かってどちらにせよ生育にむかない環境になってしまいます。とすれば、たんに漠然と「冷害に強い」というのではなく、どのような状況の植物のどこを変えたらばよいのかをカチッと考える必要があるかもしれませんね。
Ｑ：本講義では、系Ⅰの光阻害のメカニズムについて学んだ。低温条件下において光阻害が起きるということは、低温条件下で活性が弱まる酵素反応と合致するため、活性酸素消去系を担う何らかの酵素が関係しているのではないかという予想が立てられた。この酵素の活性が失われる、弱まる理由としては至適範囲を大きく外れた温度やpHである。仮に酵素が低温感受性に関係しているのならば、至適温度は酵素それぞれ異なるため、酵素の違いにより低温感受性を持つ植物、持たない植物が表れていると考えられる。これを確かめるためには、低温感受性植物に対し至適温度の低い酵素の導入により低温感受性の有無を確認することで、酵素の至適温度の際により低温感受性の有無が確認できる。
Ａ：原理的にはその通りなのですが、一般的な酵素の温度依存性は、高温側の熱失活を除けば、低温側から高温側へと緩やかに活性が上昇します。他方、キュウリなどの低温阻害においては、光合成活性の温度依存性は閾値を持っており、ある温度で急激に低下します。酵素活性の温度依存性で低温感受性を説明しようとする場合には、そのあたりの矛盾をうまく説明する必要があるでしょう。